產(chǎn)品中心

組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)

Tissue/Cell DNA Extraction Kit

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3.快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
  多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長(zhǎng)度可達(dá)30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

三.適用范圍：
    適用于快速提取各種動(dòng)植物細(xì)胞/組織基因組DNA。

四.儲(chǔ)存條件：
1.結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2.為避免降低活性、方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1ml滅菌水溶解，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2.需要自備1XPBS(磷酸鹽緩沖液),和異丙醇。
3.實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃?zhèn)溆谩?br /> 4.結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5， pH過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

關(guān)于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長(zhǎng)期放置過(guò)程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強(qiáng)堿性溶液，若不小心碰到，請(qǐng)用大量自來(lái)水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過(guò)程中可能有沉淀生成，請(qǐng)加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個(gè)新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液預(yù)處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
  提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
  提示：平衡液預(yù)處理吸附柱備用：使用平衡液預(yù)處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見(jiàn)前文“關(guān)于平衡液的使用”。

1.組織培養(yǎng)細(xì)胞
 a.收集約105-106懸浮細(xì)胞到一個(gè)1.5ml離心管；對(duì)于貼壁細(xì)胞，應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來(lái)收集。
 b.13,000rpm離心10秒，使細(xì)胞沉淀下來(lái)。棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)和大約10-20μl殘留的液體。
 c.加200μl 1XPBS重懸洗滌細(xì)胞，13,000rpm離心10秒，使細(xì)胞沉淀下來(lái)。完全吸棄上清, 將細(xì)胞沉淀重懸于180μl 1XPBS中。
 d.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。
   可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結(jié)合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
 e.冷卻后加100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
 f.將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
 g.接操作步驟項(xiàng)下4。

2.動(dòng)植物組織（例如鼠肝腦或者植物葉片）
 a.新鮮或者解凍的組織在液氮中研磨成細(xì)粉后或者用解剖刀切成小碎塊（切成微塊可以提高產(chǎn)量）后取20-50mg，轉(zhuǎn)入裝有180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
 b.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
 c.將裂解物放置在55℃水浴1-3小時(shí)或者直到組織消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
   可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
 d.加入200μl 結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。
 e.冷卻后加100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
 f.用1ml的槍頭吸取混合物，將混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液。
   如果有不溶組織物可能堵住槍頭，可將槍頭在吸水紙上輕蹭去除不溶物；如果吸上來(lái)的混合物少則可以將槍頭和不溶物一起棄去，該做法是為了去除不溶物，以免堵塞離心柱。
 g.接操作步驟項(xiàng)下4。

3.動(dòng)物組織（鼠尾）
 a.將0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎（一定要剪0-2cm范圍內(nèi)的尾巴尖，否則裂解效果不好），或者在液氮中研磨組織成細(xì)粉后，轉(zhuǎn)入裝有180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大口徑槍頭吹打混勻。
 b.加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
 c.將裂解物放置在55℃水浴3小時(shí)或者直到組織消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
   可選做步驟: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟c后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
 d.用一個(gè)1ml不帶針頭的一次性輸液器抽打裂解物2-3次。
 e.加入200μl 結(jié)合液CB和100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。
 f.13,000rpm 離心5分鐘，將上清加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
 g.接操作步驟項(xiàng)下4。
  上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15秒混勻。

4.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

5.加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

6.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

8.取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

 洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

9.DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。

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