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單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指由于單個核苷酸堿基的改變而導致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個體的同一條染色體或同一位點的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一致而只有一個堿基不同的現(xiàn)象，這就是SNP。

 

由于SNP在人類基因組中數(shù)量較多，發(fā)生頻率較高，因此被認為是繼微衛(wèi)星之后的新一代遺傳學標記，在醫(yī)學遺傳學、藥物遺傳學、疾病遺傳學、疾病診斷學、以及人類進化等研究領域都有著很高的研究價值和應用前景。

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SNP/單核苷酸多態(tài)性分析技術平臺：

1. 直接測序法（PCR-測序法）
2．Taqman-MGB探針SNP分型
3．PCR-RFLP酶切SNP分型
4．PCR-LDR連接酶檢測SNP分型
5．Multiplex SNaPshot SNP分型
6．Sequenom MassArray SNP分型
7. KASP SNP分型

1．直接測序分型（PCR-測序法）

1.1 技術原理：對欲檢測片段進行直接PCR擴增、采用ABI 3730xl DNA測序儀測序，純合型SNP位點的測序峰為單一峰型，而雜合型SNP位點的測序峰為套峰，因而很容易將其區(qū)分開來，通過直接測序方法進行SNP檢測的檢出率接近100%。測序分型主要通過直接測序的方法來確定位點的基因型，這種分型方法準確性最高，但費用大。如果需要檢測的幾個SNP位點正好位于一個測序單元內（長度小于700bp），則單個位點的分型費用可顯著降低，這種分型技術不失為一種良好選擇。對于準確性要求特別高或樣本量特別小（幾個或幾十個）的項目，這種分型技術非常適合。

 

實驗結果圖：

1.2 服務內容：

1. 樣品基因組DNA提取：   需收取核酸提取費用

2. 引物設計及合成：         僅收取引物合成費用

3. PCR擴增及純化：          需收取PCR擴增及純化費用

4. ABI 3730xl測序：           測序費用

5. 數(shù)據(jù)分析整理：             測序峰圖分析，SNPs結果和實驗報告整理

1.3 適宜范圍：

1. 需要檢測的幾個SNP位點正好位于一個測序單元內（長度小于600bp）的分型項目；

2. 對于準確性要求特別高或樣本量特別小（幾十個）的分型項目，如對其它SNP分型方法準確性的驗證。

 

2．Taqman-MGB探針SNP分型

2.1 技術原理：以SNP分型檢測為例，在PCR過程中，兩個探針能與正向引物和反向引物之間的互補序列特異退火結合。當探針以完整形式存在時，由于能量共振轉移，熒光基團只發(fā)出微弱熒光。特異的探針與相應的等位基因雜交后，DNA聚合酶發(fā)揮5’外切酶活性，把報告熒光基團切割下來，從而發(fā)出熒光；而SNP探針的錯配形式不會引起切割，無熒光信號。MGB分子結合到DNA螺旋小溝，通過穩(wěn)定MGB探針/模板提高雜交穩(wěn)定性，使短至13個堿基的探針獲得高錯配區(qū)分辯別能力。MGB探針包括一個不發(fā)熒光的淬滅基團（NFQ），極大消除傳統(tǒng)淬滅基團產生的背景熒光，提高信噪比，從而提高檢驗靈敏性。

 

原理及流程示意圖：

2.2 技術優(yōu)勢：

1. 采用最先進的ABI 7900HT系統(tǒng)采用激光掃描并激活96/384孔板每個反應孔的熒光染料，熒光信號通過光柵分光，經過分離的多色熒光同時到達CCD攝像機，實現(xiàn)多色熒光同時檢測。

2. 采用ABI 專利技術的TaqMan-MGB 探針：MGB探針包括一個不發(fā)熒光的淬滅基團（NFQ），極大消除傳統(tǒng)淬滅基團產生的背景熒光，提高信噪比，從而提高檢驗靈敏性，另外MGB(小溝結合物)增加Tm值，使探針設計產度縮短至約15bp，提高了探針設計的靈活性。

 

2.3 技術特點：

1. 適合位點少，樣本通量高的檢測，每個位點需要合成一對探針，探針合成費用高；

2. 應用ABI7900、ABI7500定量PCR儀進行定量檢測；

3. 操作簡便，只需一步 PCR 反應，無須純化和預處理，直接上機檢測；

4. 結果清晰，軟件分析結果界面友好，標出每個樣本的基因型及熒光強度，非常直觀；

 

2.4 適用范圍：

特別適合樣本數(shù)量超過1500個以上，位點數(shù)量比較少的SNP分型。

 

3．限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）技術

3.1 技術原理：

用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，由于不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶，所以可以直接在凝膠電泳上對其多態(tài)性進行分辨。

 

原理及流程示意圖：

3.2 技術特點：

1. 適合位點數(shù)量少，樣本通量高的檢測（檢測位點需要有合適的酶切位點存在）

2. 結果清晰直觀

3.3 服務內容：

1. 位點查詢，內切酶確定購買

2. 擴增引物設計，調試

3. PCR擴增特定位點，PCR產物電泳檢測

4. 酶切鑒定分析，電泳檢測

5. 電泳檢測結果記錄，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

 

4．PCR-LDR連接酶檢測SNP分型

4.1 技術原理：

主要應用連接酶檢測反應 (ligase detection reaction，LDR)技術。即在Taq DNA連接酶的作用下, 當左右兩條寡核苷酸探針與目的DNA序列完全互補，并且兩條探針之間沒有空隙時才能發(fā)生連接反應，否則連接反應不能進行，最后通過熒光掃描片段長度，根據(jù)測序峰移動的膠位置，通過末端未標記探針的3個堿基差異，確定同一位點的不同基因型，再通過末端未標記探針的7個堿基差異，確定不同位點，最終實現(xiàn)對SNP 位點的精確檢測。

原理及流程示意圖：

4.2  PCR-LDR技術流程：

1. 多重PCR擴增：獲得目標位點所在的片斷；

2. 多重LDR：得到長度各異的檢測產物；

3. 3730測序儀檢測：根據(jù)測序電泳得到不同的峰值；

4. 判斷SNPs結果，數(shù)據(jù)分析；

 

4.3 方法特點：

1. 通用性強：適用任何多態(tài)性位點和各種SNP位點的分型，不需要人工引入酶切位點；

2. 分型準確，檢出率高：其準確度可達99.2%以上。

3. 檢測快速：LDR技術的最大優(yōu)點就是實驗時間短！與Taqman、RFLP、SSCP和DHPLC相比，由于檢測條件更易控制，從DNA樣本到數(shù)據(jù)的產出，整體實驗只需要幾周。

 

4.4 適宜范圍：

適宜 100-1000個樣品，1-5個位點；

5．Multiplex SNaPshot SNP分型

5.1 技術原理：

在一個含有測序酶，四種熒光標記的ddNTP,緊挨多態(tài)位點5’端的不同長度延伸引物和PCR產物模板的反應體系中，引物延伸一個堿基即終止，經ABI測序儀跑膠后，根據(jù)峰的顏色可知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型，根據(jù)峰移動的膠位置確定該延伸產物對應的SNP位點。對于PCR產物模板可通過多重PCR反應體系來獲得，通常用于6-30個SNP位點分析。

技術原理：

5.2 技術優(yōu)勢：

1. 分型準確：該技術也稱微測序技術，其準確度僅亞于直接測序；

2. 多位點同時檢測：最多可同時檢測12個位點；

3. 可檢測出受污染的樣本：如果一個樣本的分型峰譜偏離正常的分布，它可提示該樣本可能受到污染或濃度過低；

 

5.3 適宜范圍：

適合中高通量SNP檢測，位點范圍6-50個，樣本量范圍100-3000個。

 

6．Sequenom MassArray分型

6.1 技術原理:先通過PCR擴增目標序列，然后加入SNP序列特異延伸引物，在 SNP位點上，延伸 1個堿基。將制備的樣品分析物與芯片基質共結晶后在質譜儀的真空管經強激光激發(fā)，核酸分子離解吸附為單電荷離子，電場中離子飛行時間與離子質量成反比，通過檢測核酸分子在真空管中的飛行時間而獲得樣品分析物的精確分子量，從而檢測出SNP位點信息。

 

原理及流程示意圖：

6.2 技術優(yōu)勢：

1. 高通量檢測,簡單靈活:采用Sequenom 384芯片平臺，能為受檢樣品設計最高可達30重的PCR反應，從而通過一次實驗即可獲得每個樣品多達30個SNP位點的多態(tài)性研究數(shù)據(jù)，節(jié)省檢測經費，縮短檢測時間，提高了檢測效率。用戶可以自行定義待測SNP位點和樣品數(shù)，每天能夠檢測6張384芯片/臺儀器，單個樣品一次最多可檢測30多個位點，位點檢出率≥90%，樣品檢出率＞95%，重復性＞98%；

 

2. 結果準確，靈敏度高：結合單堿基延伸技術,利用質譜直接檢測物質分子量，MassArray反應體系為非雜交依賴性，不存在潛在的雜交錯配干擾，也不需要引入各種熒光標記物，有效避免由于熒光標記效率導致的實驗誤差，實驗檢測結果準確，穩(wěn)定性強，結果重復性好；

 

6.3 適宜范圍：適合中高通量SNP檢測,簡單靈活,結果準確,靈敏度高,價格實惠;

 

7. KASP SNP分型

7.1 技術原理:

KASP-競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR），該技術是基于引物末端堿基的特異匹配來對SNP分型以及檢測InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)，采用2個熒光探針、2個通用淬滅探針，再加多個位點特異探針來檢測多個SNP位點，采用全自動核酸提取儀、熒光定量PCR平臺，靈活采用96孔板、384孔板，一天可檢測幾萬個SNP 位點。

KASP技術原理上類似Taqman檢測，也是基于終端熒光讀取判斷，每孔采用雙色熒光檢測一個樣本的一個位點可能的兩種基因型，而KASP技術與Taqman技術不同的是，它不需要每個SNP位點都去合成特異的熒光引物，它基于自己獨特的ARM PCR原理，讓所有的位點檢測最終都使用通用熒光引物擴增，這大大降低了LGC KASP的試劑成本，既有金標準的準確，又降低了使用成本，比Taqman還具有更好的位點適應性，所以在醫(yī)學、農學檢測方面KASP都有非常好的應用。

7.2 KASP技術特點：
1.優(yōu)異的準確性
- 獨立評價的準確性>99.8% 
- 業(yè)內領先的SNP&InDel 分析的轉化率(>90%)
2.超強的靈活性
- 設計的高度靈活性帶來更高的成功率
- 支持低/中/高通量研究以及單個重復實驗
- 對液體處理系統(tǒng)，PCR儀和熒光分析儀等設備有良好的兼容性
3.前所未有的低成本
- 無需昂貴的雙色標記探針，同樣成本獲得兩倍數(shù)據(jù)量
- 最低的DNA樣本需求 (根據(jù)基因組大小不同只需 0.1-10 ng) 
- 無需全基因組擴增 (Whole Genome Amplification, WGA)

由于KASP實驗方案的高度靈活性，其應用也十分廣泛，適合于各種基因分型研究，無論是中低通量SNP研發(fā)項目，NGS之后的SNP驗證，農業(yè)種群研究，或者大量種子的生產QC和生物樣品庫 DNA Biobanking等都是其適用的范圍。

實驗步驟：

散點圖結果：

服務內容：根據(jù)客戶的要求和課題特點，提供一站式SNP基因分型服務

1、課題的設計咨詢包括檢測位點的篩選；

2、全血和組織樣本基因組DNA提取（費用另算）；

3、DNA樣本的質檢；

4、根據(jù)樣品數(shù)量和分型位點數(shù)，推薦成本最低的分型方法；

5、SNP分型所用引物的設計、合成與優(yōu)化；

6、SNP基因分型；

7、分型數(shù)據(jù)的質量質控；

8、提交實驗報告

 

分型數(shù)據(jù)的質量質控：

1、陰性陽性對照：每批分型實驗都設計陰性（H2O）、陽性對照；

2、重復對照：在實驗完成后隨機選取5%的樣品做重復實驗（單獨收費）；

3、測序驗證：隨機選取2%的樣品進行測序驗證（單獨收費）。

 

客戶需要提供：

1. 細胞（≥106 個）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等樣品材料，核酸提取費用單獨收費；

2. 基因組DNA（體積≥30μl，濃度≥50 ng/μl），純度 OD260/280 為1.7～1.9之間；

3. 人類基因組需提供SNP位點的RS號。其它物種如牛、雞、魚等無rs號的，需提供SNP位點上下游各200bp的確切序列，SNP位點的突變類型，以及位點的上下游25bp內是否存在其它連鎖位點。

 

最終提交結果：

1. SNPs結果（ExceL表格）；

2. 完整實驗報告：擴增和反應體系、所涉及的引物、探針序列；

3. 客戶所需要的其他相關資料；