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Multi One Step Cloning Kit
一步法同源重組定向克隆試劑盒(單/多片段連接)

包裝規(guī)格：

編號(hào)	產(chǎn)品名稱	規(guī)格	目錄價(jià)
V6006-25	Multi One Step Cloning Kit一步法同源重組定向克隆試劑盒(單/多片段連接)	25T	1000
V6006-50	Multi One Step Cloning Kit一步法同源重組定向克隆試劑盒(單/多片段連接)	50T	1600
V6006-100	Multi One Step Cloning Kit一步法同源重組定向克隆試劑盒(單/多片段連接)	100T	3000

產(chǎn)品介紹：
Multi One Step Cloning技術(shù)是一種簡單、快速并且高效的DNA無縫克隆技術(shù)。本試劑盒能通過識(shí)別DNA片段和線性化載體末端20個(gè)堿基的同源序列來將DNA片段不經(jīng)酶切，定向克隆到目的載體的任意位置上。將線性化載體和目的片段按一定比例混合后，通過One Step Cloning的催化，僅需反應(yīng)15-60min即可進(jìn)行重組反應(yīng)，完成定向克隆。

1. 可以將DNA片段克隆到載體的任意位點(diǎn)。
2. 可以同時(shí)重組克隆1-5個(gè)DNA片段到載體上。
3. 重組反應(yīng)不依賴連接酶，降低自連背景 。
4. 可以成功重組80bp-50kb的DNA片段到載體上。

產(chǎn)品儲(chǔ)存：

-20℃保存，避免反復(fù)凍。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.30分鐘可以將一個(gè)或者多個(gè)長、短PCR擴(kuò)增片段（平端、A端均可）插入載體。
2.不受載體和插入片段酶切位點(diǎn)的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位點(diǎn)進(jìn)行克隆。
3.無縫克隆，插入點(diǎn)不會(huì)引入不需要的堿基序列。
4.高效、準(zhǔn)確，陽性率＞95% 。

適用范圍：

適用于快速克隆，定向克隆，定點(diǎn)突變。

實(shí)驗(yàn)示意圖：

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1. 重組引物設(shè)計(jì)：

重組引物的設(shè)計(jì)是Multi One Step Cloning成功的關(guān)鍵。

重組引物設(shè)計(jì)的原則為:
1. 引物5’端需要包含與將要連接的載體末端完全同源的15-20個(gè)堿基，退火溫度處于50°C-65°C之間；
2. 引物3’端需要包含靶基因特異引物序列。通過該原則設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增，可使片段與片段間，或者片段與引物間產(chǎn)生15-20bp相互同源的序列。其次在設(shè)計(jì)重組引物時(shí)要考慮避免引物自身或上下游引物間形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者產(chǎn)生引物二聚體，以免影響下游實(shí)驗(yàn)。

具體設(shè)計(jì)原則如下：
1.引物重組臂區(qū)域TM值參考范圍控制在45℃-65℃之間。
2.與載體互補(bǔ)的引物重組臂序列應(yīng)盡量減少自身重復(fù)或與載體附近有連續(xù)重復(fù)情況，不然會(huì)導(dǎo)致重組失敗或錯(cuò)誤重組出現(xiàn)。

2. DNA片段的制備：
DNA片段制備過程中可以使用任意的PCR酶工具（Taq酶或高保真酶）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，Taq酶擴(kuò)增產(chǎn)生的PolyA不會(huì)影響正確重組，但為了減少潛在的突變風(fēng)險(xiǎn)，建議使用高保真酶進(jìn)行DNA片段的制備。

PCR產(chǎn)物可以通過柱回收試劑盒或膠回收試劑盒來純化。如果PCR產(chǎn)物特異性不好，就必須通過凝膠回收試劑盒來回收正確的PCR產(chǎn)物，以確保正確的DNA片段被克隆目的載體上。

3. 線性化載體的制備：
重組克隆前，需要選擇目標(biāo)載體合適的位置進(jìn)行線性化，推薦盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量較均一的區(qū)域進(jìn)行重組克隆。線性化載體可以通過酶切或反向PCR獲得，兩者都需要通過柱回收試劑盒或凝膠回收試劑盒回收。因?yàn)閮?nèi)切酶酶切效率不高和反向PCR帶入的環(huán)狀質(zhì)粒都會(huì)使得載體線性化不徹底，從而導(dǎo)致克隆實(shí)驗(yàn)假陽性克隆多，因此增加酶切時(shí)間，增大酶切體系或減少反向PCR擴(kuò)增時(shí)加入的質(zhì)粒模板量會(huì)減少假陽性背景的出現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1. 重組反應(yīng)組分及用量：

組分	反應(yīng)數(shù)量	陽性對(duì)照
2 × Cloning Master Mix	5ul	5ul
insert片段	50-300ng*	4.5 ul
Linear Vector線性化載體	20-150ng*	3 ul
去離子水	to 10ul	0.5 ul

2. 按照下表建立反應(yīng)體系（可使用PCR管在冰上操作）：

2 × Cloning Master Mix	5 μl(最后加入)
Linear Vector (10-80 ng)	X μl*
Insert(s)	Y μl*
dd H2O	To 10 μl

* 對(duì)于最佳重組體系，插入片段的質(zhì)量應(yīng)該是線性化載體的質(zhì)量的2倍。
* 對(duì)于載體或插入片段較大時(shí) (>10K), 你可以將重組反應(yīng)體系增加到 20ul，線性化載體和片段使用量要翻倍加入。

3. 使用移液器輕輕吸打混勻(請(qǐng)勿振蕩混勻)，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將重組反應(yīng)至于50°C孵育30-60分鐘，然后置于冰上或放于-20°C保存，直到轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備工作完成。

5. 將新鮮感受態(tài)細(xì)胞放于冰上緩慢解凍。

6. 取5-10ul反應(yīng)產(chǎn)物加入到100ul感受態(tài)細(xì)胞中。輕混勻并放置于冰上靜置30分鐘。

7. 將含有反應(yīng)液的感受態(tài)細(xì)胞放入水浴鍋中42°C 熱擊90 秒。

8. 立即放置于冰上5分鐘。

9. 將800ul SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素）添加到感受態(tài)細(xì)胞中。

10. 將單管放入37°C搖床中220 rpm搖菌60分鐘。

11. 5000rpm離心5 分鐘, 丟棄大約750ul上清液. 輕懸剩余細(xì)胞液。

12. 使用涂布棒將轉(zhuǎn)化液涂勻在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，37°C倒置孵育12-16h。

13. 重組反應(yīng)鑒定：
建議通過使用陽性對(duì)照和陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)試劑盒組分是否保持正常功能。通常情況下，陽性對(duì)照平板能得到幾百個(gè)克隆，而陰性對(duì)照平板克隆數(shù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于陽性克隆數(shù)。陽性插入片段需要通過菌落PCR實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行篩選，正常情況下陽性率都能達(dá)到90%以上，可再陽性菌液接種至含有適當(dāng)抗生素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，再提取質(zhì)粒進(jìn)行一代測(cè)序和酶切鑒定。