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核酸、蛋白質(zhì)雜交用相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法

20×SSC   

組份濃度 3.0 MNaCl，0.3 MNa3citrate·2H2O(檸檬酸鈉·2H2O)

配制量   1 L

配制方法  

1.稱量下列試劑，置于l L燒杯中。

NaCl	175.3 g
檸檬酸鈉·2H2O	88.2 g

2.向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?

3.滴加14 N HCl，調(diào)節(jié)pH值至7.0后，加去離子水將溶液定容至1 L。

4.高溫高壓滅菌后，室溫保存。

20×SSPE Buffer 

組份濃度 3.0 MNaCl，0.2 MNaH2PO4，0.02 MEDTA

配制量    1.L

配制方法  

1.稱量下列試劑，置于l L燒杯中。

NaCl	175.3 g
NaH2PO4·H2O	27.6 g
Na2EDTA·2H2O	7.4 g

2.向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?

3.加NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4(約6.5 ml的10 N NaOH)。

4.加去離子水將溶液定容至l L。

5.高溫高壓滅菌后，室溫保存。

50 X Denhardt’S溶液 

組份濃度

1%(W/V)	Ficoll 400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)
1%(W/V)	Polyvinylpyrrolidone(聚維酮/聚乙烯吡咯烷酮)
1%(W/V)	BSA

配制量    500 ml

配制方法  

1.稱量下列試劑，置于500 ml燒杯中。

Flcoll 400	5 g
Polyvinylpyrrolidone	5 g
BSA	5 g

2.加去離子水約400 ml，充分?jǐn)嚢枞芙?

3.加去離子水將溶液定容至500 ml。

4.用0.45μm濾膜過濾后，分裝成每份25 ml。

5.-20℃保存。

0.5 M 磷酸鹽Buffer 

組份濃度 0.5 M Na2HPO4。

配制量    l L

配制方法  

1.稱量134 gNa2HPO4·7H2O置于1 L燒杯中。

2.加入約800 ml的去離子水充分?jǐn)嚢枞芙狻?

3.加入85%的H3PO4(濃磷酸)調(diào)節(jié)溶液pH值至7.2。

4.加去離子水定容至1 L。

5.高溫高壓滅菌后，室溫保存。

Salmon DNA  (鮭魚精DNA)  

組份濃度  10 mg/ml Salmon DNA

配制量    約100 ml

配制方法 

1.稱取鮭魚精DNA2 g置于500 ml燒杯中，加入約200 ml的TE Buffer。

2用磁力攪拌器室溫?cái)嚢?~4h,溶解后加入4ml的5 MNaCl，使其終濃度為0.1 M。

3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。

4.回收水相溶液后，使用17號(hào)皮下注射針頭快速吸打溶液約20次，以切斷DNA。

5.加入2倍體積的預(yù)冷乙醇進(jìn)行乙醇沉淀。

6.離心回收DNA后，溶解于100 ml的去離子水中。測(cè)定溶液的OD260值。

7.計(jì)算溶液的DNA濃度后，稀釋DNA溶液至10 mg/ml。

8.煮沸10min后，分裝成小份(1 ml/份)。-20℃保存。

9.使用前在沸水浴中加熱5min后，迅速冰浴冷卻。

DNA變性緩沖液

組份濃度 1.5 MNaCl，0.5 MNaOH

配制量   1 L

配制方法  

1.稱量下列試劑，置于l L燒杯中。

NaCl	87.7 g
NaOH	20 g

2.向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?

3.加去離子水將溶液定容至l L后，室溫保存。

預(yù)雜交液/雜交液 (DNA雜交用)

組份濃度

6×	SSC(或SSPE)
5×	Denhardt’s
0.5%(W/V)	SDS
100 μg/ml	Salmon DNA

 配制置    100 ml

 配制方法 

1.稱量下列試劑，置于200 ml燒杯中。

20×SSC(或SSPE)	30 ml
50×Denhardt’s	10 ml
10% SDS	5 ml
10 mg/ml Salmon DNA	1 ml
dH2O	54 ml

2.充分混勻后，使用0.45 μm濾膜濾去雜質(zhì)后使用。

預(yù)雜交液/雜交液(RNA雜交用)

組份濃度

6×	SSC(或SSPE)
5×	Denhardt‘s
0.5%(W/V)	SDS
100 g/ml	Salmon DNA
50%(V/V)	Formamlde(甲酰胺)

配制量    100 mL

配制方法  

1.稱量下列試劑，置于200 ml燒杯中。

20×SSC(或SSPE)	30 ml
50×Denhardt’s	10 ml
10% SDS	5 ml
10 mg/ml Salmon DNA	1 ml
Formamide(甲酰胺)	50 ml
dH2O	4 ml

2.充分混勻后，使用0.45μm濾膜濾去雜質(zhì)后使用。

膜轉(zhuǎn)移緩沖液(Western雜交用) 

組份濃度 39 mMGlycine，48 mMTris，0.037%(W/V)SDS，20%(V/V)甲醇

配制量   1 L

配制方法  

1.稱量下列試劑，置于l L燒杯中。

Glycine	2.9 g
Tris	5.8 g
SDS	0.37 g

2.向燒杯中加入約600 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?

3.加去離子水將溶液定溶至800 ml后，加入200 ml的甲醇。

4.室溫保存。

TBST Buffer(Western雜交膜清洗液) 

組份濃度 20 mMTris-HCl，150 mMNaCl，0.05%(V/V)Tween 20

配制量   1 L

配制方法  

1.稱量下列試劑，置于l L燒杯中。

NaCl	8.8 g
1 MTris-HCl(pH8.0)	20 ml

2.向燒杯中加入約800 ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙狻?

3.加入0.5 ml Tween 20后充分混勻。

4.加去離子水將溶液定容至l L后，4℃保存。

封閉緩沖液(Western雜交用)

組份濃度  5%(W/V)脫脂奶粉/TBST Buffer

配制量    100 ml

配制方法  

1.稱5 g脫脂奶粉加入到100 ml TBST Buffer中，充分?jǐn)嚢枞芙狻?

2. 4℃保存待用(本封閉液應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用)。