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中量大量組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒(溶液型)

Midi Tissue/Cell DNA Isolation Kit(Solution)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
本試劑盒用于快速的從動(dòng)植物細(xì)胞/組織中提取基因組DNA。樣品研磨或者勻漿后加入細(xì)胞核裂解液，首先在強(qiáng)去污劑或者和蛋白酶K協(xié)同作用下裂解細(xì)胞釋放出基因組DNA，接著加入RNase A去除RNA，然后蛋白沉淀液選擇性沉淀去除蛋白，最后純凈的基因組DNA通過(guò)異丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑。
2.快速，簡(jiǎn)捷，組織樣品操作整個(gè)過(guò)程可在1個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。
3.結(jié)果穩(wěn)定，產(chǎn)量高（比離心柱型的產(chǎn)量高一倍以上），OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長(zhǎng)度可達(dá)50kb-150kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)以及文庫(kù)構(gòu)建。

三.適用范圍：
   適用于快速提取各種動(dòng)植物細(xì)胞/組織基因組DNA。

四.儲(chǔ)存條件：
1.環(huán)境溫度低時(shí)細(xì)胞核裂解液中某些去污劑成份會(huì)析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，輕輕旋搖，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過(guò)量的泡沫。
2.蛋白沉淀液可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影響使用效果，直接取用上層溶液即可。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類(lèi)似離心機(jī)。
2.用戶需自備異丙醇、70％乙醇、PBS(用于細(xì)胞)、液氮研缽/或勻漿器(用于組織）、0.5M EDTA和蛋白酶K(用于鼠尾)、水浴箱。
3.開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱好備用。
4.本試劑盒為溶液型，可以很容易的按照比例擴(kuò)大或者縮小每次處理的組織細(xì)胞量，請(qǐng)聯(lián)系我們索取其它處理量的操作手冊(cè)。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
1.組織培養(yǎng)細(xì)胞
a.收集6-8×107個(gè)細(xì)胞到一個(gè)50 ml離心管；對(duì)于貼壁細(xì)胞，應(yīng)該先用胰蛋白酶消化后吹打下來(lái)收集。
b.500 x g離心5分鐘，使細(xì)胞沉淀下來(lái)。棄上清，留下細(xì)胞團(tuán)和大約100μl殘留的液體。
c.加3 ml PBS重懸洗滌細(xì)胞，重復(fù)上一步驟，高速渦旋振蕩重懸細(xì)胞團(tuán)。
d.對(duì)于細(xì)胞核裂解液裂解效果不好的細(xì)胞系（例如PC12細(xì)胞），在做下一步驟前，應(yīng)該做幾次凍融循環(huán)：凍于液氮后，在95℃水浴融化，重復(fù)4次。
e.加入9 ml細(xì)胞核裂解液，用大口徑的槍頭（剪去槍頭尖）輕柔吹打裂解細(xì)胞直至看不見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)塊(如有必要可以37℃溫育幫助裂解)。
f.接操作步驟項(xiàng)下4。

2.動(dòng)物組織（例如鼠肝腦）
a.9 ml冰預(yù)冷的細(xì)胞核裂解液加入300mg新鮮或者解凍的組織，勻漿器勻漿完全，將裂解物轉(zhuǎn)入50ml離心管。另一種方法：在液氮中研磨300mg組織成細(xì)粉后，轉(zhuǎn)入裝有9ml 冰預(yù)冷細(xì)胞核裂解液的50ml離心管， 用大口徑槍頭吹打混勻。
b.將裂解物放置在65℃水浴15-60分鐘。
如果需要最大的產(chǎn)量，可加入45μl蛋白酶K (20mg/ml)，顛倒25次混勻，55℃水浴3小時(shí)或者過(guò)夜。直到組織溶解，中間不時(shí)顛倒混勻。
c.接操作步驟項(xiàng)下4。

3.植物組織
a.在液氮中研磨植物組織（200m干組織或400mg濕組織）成細(xì)粉后，轉(zhuǎn)入裝有9ml冰預(yù)冷的細(xì)胞核裂解液的50 ml離心管， 用大口徑槍頭吹打混勻。
植物組織起始處理量應(yīng)該根據(jù)葉齡、種類(lèi)、基因組大小調(diào)整。
b.將裂解物放置在65℃水浴15-60分鐘，期間至少顛倒10次。

4.加入18μl RNase A（10mg/ml）至裂解物中，即RNase A終濃度30μg/ml，顛倒混勻25次后，37℃溫育15-60分鐘去除殘留RNA。然后室溫冷卻至少5分鐘或者冰浴使回復(fù)到室溫。

5.在回復(fù)到室溫的裂解物內(nèi)加入3ml蛋白沉淀液，在渦旋振蕩器上高速連續(xù)振蕩混勻25秒?；靹蚝罂赡芤?jiàn)到一些小的蛋白團(tuán)塊。冰浴5分鐘。
由于樣品體積重量小，用渦旋振蕩器振蕩混勻產(chǎn)生的剪切力并不會(huì)剪切打斷基因組DNA。如果用手振蕩混勻，則不可以用手上下劇烈振蕩混勻，只能適當(dāng)力度振蕩混勻，否則會(huì)剪斷基因組DNA； 但是力度也不能太小，要保證充分混勻，將粘稠的裂解物打散開(kāi)，否則DNA無(wú)法和蛋白質(zhì)沉淀分離開(kāi)， 離心時(shí)會(huì)和蛋白質(zhì)一起沉淀下來(lái)，造成DNA丟失或者降低產(chǎn)量。此外混勻不充分也可能造成蛋白沉淀不充分，最后的產(chǎn)物污染有較大量的蛋白質(zhì)。因此建議用渦旋振蕩器。

6.2,500xg(可根據(jù)需要調(diào)整加大離心力)離心10分鐘。這時(shí)應(yīng)該可以見(jiàn)到管底蛋白沉淀，也可能見(jiàn)到一些蛋白沉淀漂浮在液體表面。

7.小心緩慢吸取上清到一個(gè)新的50ml離心管中，不要吸到沉淀。
吸取上清時(shí)，注意不要吸到管底的和漂浮在液體表面的蛋白沉淀。如果不小心將蛋白沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中，可再次離心2分鐘后取上清。

8.加入等體積的室溫異丙醇（約9ml），顛倒30次混勻或者直到出現(xiàn)棉絮狀（絲狀）白色DNA沉淀。
注意：顛倒混勻的時(shí)候，棉絮狀（絲狀）DNA有時(shí)會(huì)粘附著在蓋子或者管口處，即使顛倒也不跟下來(lái)，這樣導(dǎo)致操作者看不到沉淀，誤認(rèn)為沒(méi)有得到DNA。解決辦法是略去步驟9，直接2,000xg離心3-5分鐘，棄上清，然后接步驟11。

9.垂直放置離心管，讓白色DNA沉淀自然沉到管底，然后盡可能多的吸棄上清，注意不要吸到沉淀。
如果棉絮狀（絲狀）DNA沉淀附著有氣泡，則會(huì)漂浮在液體表面，而不會(huì)沉淀下來(lái)，要小心避開(kāi)沉淀吸取上清，不要把沉淀給吸掉了。

10.加入9ml 70％乙醇后，顛倒幾次漂洗DNA沉淀，2,000xg離心3-5分鐘，在管底可以見(jiàn)到白色的DNA沉淀塊，倒棄上清。

11.加入5ml 70％乙醇，顛倒幾次漂洗DNA沉淀，2,000xg離心1分鐘， 倒去上清（注意不要把DNA沉淀倒掉了），倒置后在吸水紙上輕敲幾下以控干殘留乙醇，還可以用槍頭小心吸掉管底沉淀周?chē)凸鼙诘臍埩粢掖?，空氣晾干沉淀幾分鐘?br /> 注意不要干燥過(guò)頭，否則DNA極其難溶；也不能殘留太多乙醇，否則乙醇可能抑制下游如酶切反應(yīng)。

12.加入500μl DNA溶解液重新水化溶解DNA沉淀，輕彈管壁混勻，可以放置在65℃溫育60分鐘（不要超過(guò)一小時(shí)），也可以在室溫或者4℃放置過(guò)夜來(lái)重新水化DNA，中間不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水化DNA。

13.DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。