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酵母基因組DNA提取試劑盒（含Lytic Enzyme）

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
該試劑盒采用DNA吸附柱和獨(dú)有的溶液系統(tǒng)，適合于從多種來(lái)源的酵母培養(yǎng)物中快速簡(jiǎn)單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生長(zhǎng)期的酵母培養(yǎng)液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質(zhì)量的基因組DNA。純化DNA產(chǎn)物可直接用于PCR、酶切和雜交等實(shí)驗(yàn)。酵母細(xì)胞經(jīng)lytic Enzyme處理去除細(xì)胞壁后，獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3.快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品裂解后操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

三.適用范圍：
    適用于快速提取各種酵母基因組DNA。

四.儲(chǔ)存條件：
1.結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2.為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀（20mg），收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。
3.Lytic Enzyme為蝸牛酶甘油儲(chǔ)液，因此比較粘稠，請(qǐng)小心取用，－20℃保存。 蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶。適合破碎溶解各種酵母的細(xì)胞壁。
4.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2.需要自備乙醇、異丙醇、 β-巰基乙醇。 
3.開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到37℃和70℃?zhèn)溆谩?br /> 4.結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，用大量清水或者生理鹽水沖洗。
5.用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié)PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.2%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M)。
6.菌體濃度檢測(cè)一般OD600值為1的時(shí)候,釀酒酵母細(xì)胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和分光度計(jì)不同即使同樣細(xì)胞數(shù)量OD值變化也很大，以上僅供參考。
7.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5， pH過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
   提示：
   第一次使用前請(qǐng)先在15ml漂洗液WB中加入60ml無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
   吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2%β-巰基乙醇，回復(fù)到室溫備用。

1.取1-3毫升酵母培養(yǎng)物(不超過(guò)3X107 cells，最好是早對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，12,000rpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集菌體。
收集超過(guò)1.5毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個(gè)1.5ml管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2.加入300μl Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞；再加入50μl Lytic Enzyme儲(chǔ)液，充分顛倒混勻，37℃溫育1-3小時(shí)消化細(xì)胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化。
如果破壁效果不好導(dǎo)致產(chǎn)量低，可以加大lytic Enzyme 用量來(lái)提高酶工作濃度，還可以延長(zhǎng)消化時(shí)間或者提高溫度到45℃來(lái)提高效果，不適合Lytic Enzyme消化的酵母可選用其它方法如0.5mm玻璃珠渦旋擊打 ，反復(fù)凍融等。玻璃珠法：向菌體中加入180μl 緩沖液YB徹底懸浮菌體，加入0.1g直徑為0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠，渦旋振蕩10分鐘，靜置幾分鐘讓玻璃珠沉淀，小心吸取上清到一個(gè)新管后接后續(xù)步驟4。

3.13,000rpm離心1分鐘，盡可能吸棄上清，加180μl 緩沖液YB充分重懸細(xì)胞團(tuán)。

4.加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。

5.將混合物放置在55℃水浴消化直到消化完全，期間輕柔的振蕩幾次幫助裂解。
所需消化時(shí)間和酵母數(shù)量、種類和生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)，一般15分鐘即可，但是如果方便的話消化過(guò)夜也無(wú)不良影響。
可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可在完成操作步驟5后加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

6.加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。 

7.冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。

8.將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

9.加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

10.加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

11.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

12.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

13.取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

14.DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。