產(chǎn)品中心

castPCR Genotyping Master Mix

包裝規(guī)格：

儲(chǔ)運(yùn)溫度：

-20℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，短期使用可放4℃。

產(chǎn)品說(shuō)明：

castPCR Genotyping Master Mix是采用Taqman探針?lè)ǜ?jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR技術(shù)（Competitive Allele-Specific Taqman PCR，castPCR）進(jìn)行SNP分析以及檢測(cè)InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)的專用2 x 預(yù)混液，只需要額外加入預(yù)先設(shè)計(jì)好的Allele 1特異檢測(cè)引物，Allele 2特異檢測(cè)引物，Locus特異擴(kuò)增引物，模板和滅菌蒸餾水即可進(jìn)行SNP分析以及檢測(cè)InDels，使用方便，采用全自動(dòng)核酸提取儀、PCR儀，3 種熒光的熒光定量PCR 儀或多通道熒光讀板機(jī)（酶標(biāo)儀），靈活采用96孔板、384孔板，一天可檢測(cè)幾萬(wàn)個(gè)SNP 位點(diǎn)。

精心研制的抗體修飾熱啟動(dòng)Taq酶，Allele 1 FAM 熒光通用引物和Allele 2 HEX 熒光通用引物，配合反復(fù)優(yōu)化的Buffer，增強(qiáng)了在低濃度和復(fù)雜模板上的分型成功率，同時(shí)本產(chǎn)品提供ROX Reference Dye用于校正加樣孔之間的體積誤差和熒光信號(hào)誤差，不用Reference Dye校正的qPCR擴(kuò)增儀器，使用時(shí)無(wú)需添加ROX。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

用Real-time PCR system型熒光定量PCR儀，采用基因分型-終點(diǎn)測(cè)定法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。96孔PCR 板及384 孔板最小反應(yīng)體系分別為10μL和5μL。

1. 反應(yīng)液的配置分裝，務(wù)必使用無(wú)污染的新吸頭，EP管，盡量避免污染。

2. 溶解所有用到的試劑，輕柔上下顛倒混勻，短暫瞬時(shí)離心將溶液甩至管底；

3.按下列組份配制qPCR混合液，將除模板以外的試劑混成mix，再分裝到單個(gè)PCR管內(nèi)，最后加入模板DNA。

注意：長(zhǎng)期保存2 x castPCR Genotyping Master Mix置于-20℃，4℃保存可保存1周，凍融請(qǐng)勿超過(guò) 3 次。

4.短暫瞬時(shí)離心后放入熒光定量PCR儀中運(yùn)行，qPCR反應(yīng)程序如下：

5.其他循環(huán)條件:

   如果未獲得明確的基因分型簇，則應(yīng)將平板熱循環(huán)額外3-10個(gè)循環(huán)，并再次讀取。

分型失敗問(wèn)題分析：

若分型失敗，請(qǐng)嘗試以下幾種解決方案：

（1）DNA 濃度過(guò)低。保證每個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)有 10ng 以上模板DNA，大基因組物種如小麥，請(qǐng)保證 100ng 以上。

（2）DNA 含有大量 PCR 抑制劑，請(qǐng)將模板進(jìn)行梯度稀釋再次嘗試，或者重新純化 DNA。

（3）DNA 濃度嚴(yán)重不均一，分型較差的樣本 DNA 含量過(guò)低。請(qǐng)重新準(zhǔn)備 DNA 樣本。

（4）PCR 循環(huán)太少。

（5）實(shí)際上分型已經(jīng)成功，但群體中只有一種等位基因型，因缺乏其它等位基因的對(duì)照，導(dǎo)致分型誤判。

（6）引物自身擴(kuò)增差。請(qǐng)更換擴(kuò)增好的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（7）引物失效，請(qǐng)重新合成引物。

（8）試劑失效。請(qǐng)?jiān)谟行趦?nèi)使用 。請(qǐng)將待使用的 試劑儲(chǔ)存在-20℃冰箱中，并減少凍融次數(shù)。

（9）使用不合格 PCR 板（管），請(qǐng)確認(rèn)該耗材可以正常進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。在潔凈度差的場(chǎng)所生產(chǎn)的板子，或者某些帶有熒光增白劑的 PCR 板（尤其是部分白色板子），有非常嚴(yán)重的自熒光現(xiàn)象，導(dǎo)致信號(hào)異常。

（10）若只有雜合和一種親本等位基因型，缺少另一種親本等位基因型。A)請(qǐng)檢查群體是否為回交世代；B） 異源多倍體的位點(diǎn)多拷貝現(xiàn)象，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)單一拷貝特異引物；C）該等位突變純合致死，無(wú)純合現(xiàn)象，或純合現(xiàn)象罕見(jiàn)。

（11）若出現(xiàn)單個(gè)嚴(yán)重離群點(diǎn)，請(qǐng)檢查：A）該 PCR 孔內(nèi)是否有顏色污染；B）該 PCR 孔是否漏加/破損泄露/ 蒸發(fā)。請(qǐng)刪除該數(shù)據(jù)點(diǎn)，并重新實(shí)驗(yàn)。

背景知識(shí)：

等位基因特異擴(kuò)增（Allele specific PCR, ASP）

在 PCR 技術(shù)發(fā)明幾年后的 1988年，等位基因特異擴(kuò)增（ASP）/擴(kuò)增受阻突變體系（Amplification refractory muta- tion system，ARMS）技術(shù)出現(xiàn)。該技術(shù)原理簡(jiǎn)單，即利用引物3’最后1~4個(gè)尤其是最后1個(gè)堿基的差異，區(qū)分并特異擴(kuò)增特定等位基因 DNA 片段。

天然 DNA 聚合酶對(duì) 3’最后幾個(gè)堿基的復(fù)性匹配/錯(cuò)配選擇并不好，早期應(yīng)用該技術(shù)須有額外的手段保證選擇性。如在引物末端人為引入新錯(cuò)配，或者調(diào)整 PCR 退火溫度， 但這些手段相對(duì)復(fù)雜且有穩(wěn)定性問(wèn)題，一直困擾著這個(gè)原理簡(jiǎn)單的 SNP 分型技術(shù)，因而應(yīng)用并不廣泛 。

KASP技術(shù)從根本上解決了 DNA 聚合酶及 PCR 體系對(duì) SNP 識(shí)別的問(wèn)題，能?chē)?yán)格進(jìn)行特異擴(kuò)增，產(chǎn)生正確的等位基因擴(kuò)增信號(hào)。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）

熒光基團(tuán)和對(duì)應(yīng)熒光淬滅基團(tuán)距離較近時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光，會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收，發(fā)射出更長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光或者放出熱量。此時(shí)在此熒光對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)內(nèi)檢測(cè)不到該基團(tuán)熒光信號(hào)。一旦二者分離， 則熒光信號(hào)可被檢測(cè)到。

采用了 FRET 原理來(lái)檢測(cè) FAM 以及 HEX 熒光引物的擴(kuò)增信號(hào)，對(duì)應(yīng)的等位基因發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，將出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)。