產(chǎn)品中心

Zero Background pTOPO-TA Simple  Cloning Kit

零背景pTOPO-TA Simple克隆試劑盒

包裝規(guī)格：

V6002-20	Zero Background pTOPO-TA Simple Cloning Kit	20T*10μL	620元
V6002-60	Zero Background pTOPO-TA Simple Cloning Kit	20T*10μL	1660元

產(chǎn)品介紹：

本制品和傳統(tǒng)的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）、高效（接近100%）連接DNA片段的原理。
1.可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）完成連接。
2.無需冰浴和熱休克，室溫5分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)化；無需1小時(shí)復(fù)蘇，只需37℃10分鐘復(fù)蘇便可以涂板。從連接到涂板只需15-20分鐘。
3.無自連、零背景，無需繁瑣藍(lán)白斑篩選，見到長出的克隆便是有插入的（接近100%）。
4.可以連接長達(dá)10kb片段（即使連接5kb片段，挑10個(gè)菌落，至少8個(gè)是有插入的），是一種簡單、快速、零背景免篩選的TOPO TA克隆載體。
本制品在克隆插入位點(diǎn)兩側(cè)不含多克隆酶切位點(diǎn)，需要在PCR擴(kuò)增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn)。此時(shí)如果使用PCR擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA酶切時(shí)，酶切反應(yīng)將不會(huì)受到T載體上其它多克隆酶切位點(diǎn)上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。

存儲(chǔ)條件：-20℃保存，至少6個(gè)月不影響使用。

測序可以采用 M13F/M13R通用引物測序（見后面圖譜）

操作步驟：

1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：
PCR引物不能磷酸化。使用能在PCR產(chǎn)物末端加一個(gè)突出的3’-A的酶系列擴(kuò)增（如Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA Polymerase）。 PCR產(chǎn)物（僅有目的條帶、無非特異條帶和引物二聚體）可直接進(jìn)行連接反應(yīng)，無需純化，否則建議膠回收純化（貨號(hào)：DR01)。如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則最好進(jìn)行純化，因?yàn)槟０遒|(zhì)粒也可能長出菌落（但不是想構(gòu)建的目的載體）。 

2.連接反應(yīng)：
1)室溫（20℃-30℃）按照如下體系操作（10ml體系）： 

純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ul 1000bp control	0.5-8ul
pTOPO-T Simple Vector	1ul
10 ′ Enhancer	1ul
滅菌水	Xul
總體積	10ul

加完試劑后，用移液器輕輕吹打混勻或者輕彈管底混勻，低速瞬時(shí)離心收集所有液體在離心管底，注意此步驟不能在冰上進(jìn)行，只能在室溫（20℃-30℃）進(jìn)行。
注：如果使用5ml體系連接，各成分按照比例減半使用，使用次數(shù)可以加倍。
不同大小插入片段的推薦用量：

插入片段大?。?span>bp）	最佳用量（ng）
100-1000	20-50
1000-2000	50-100
2000-5000	100-200