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Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit

零背景pTOPO-Blunt Simple 平末端克隆試劑盒

包裝規(guī)格：

V6002-20	Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit	20T*10μL	620元
V6002-60	Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit	20T*10μL	1660元

產(chǎn)品介紹：

本制品和傳統(tǒng)的T4連接酶原理不同，它利用了Topoisomerase可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）、高效（接近100%）連接DNA片段的原理。 
1. 可以在瞬間（幾秒鐘-幾分鐘）完成連接。 
2. 無(wú)需冰浴和熱休克，室溫5分鐘內(nèi)完成轉(zhuǎn)化；無(wú)需1小時(shí)復(fù)蘇，只需37℃10分鐘復(fù)蘇便可以涂板。從連接到涂板只需15-20分鐘。 
3. 無(wú)自連、零背景，無(wú)需繁瑣藍(lán)白斑篩選，見(jiàn)到長(zhǎng)出的克隆便是有插入的（接近100%）。 
4. 可以連接長(zhǎng)達(dá)10kb片段（即使連接5kb片段，挑10個(gè)菌落，至少8個(gè)是有插入的），是一種簡(jiǎn)單、快速、零背景免篩選的TOPO 平末端克隆載體。
本制品在克隆插入位點(diǎn)兩側(cè)不含多克隆酶切位點(diǎn)，需要在PCR擴(kuò)增引物上導(dǎo)入合適的酶切位點(diǎn)。此時(shí)如果使用PCR擴(kuò)增引物導(dǎo)入的酶切位點(diǎn)進(jìn)行DNA酶切時(shí)，酶切反應(yīng)將不會(huì)受到T載體上其它多克隆酶切位點(diǎn)上的限制酶影響，可以大大提高酶切效率，增加亞克隆成功率。
注：本TOPO載體連接體系是按照10μl 計(jì)算，如果按照其它公司產(chǎn)品5μl 計(jì)算，實(shí)際使用次數(shù)可以增加一倍，20次實(shí)際可用40次。 
測(cè)序可以采用 M13F/M13R通用引物測(cè)序（見(jiàn)后面圖譜）

產(chǎn)品存儲(chǔ): －20℃儲(chǔ)存，至少6個(gè)月內(nèi)不影響使用效果。

操作步驟：
1.連接反應(yīng)的準(zhǔn)備：
PCR引物不能磷酸化。使用擴(kuò)增產(chǎn)物是平末端的高保真聚合酶系列擴(kuò)增（如Pfu、Vent、Phusion DNA Polymerase）。 PCR產(chǎn)物（僅有目的條帶、無(wú)非特異條帶和引物二聚體）可直接進(jìn)行連接反應(yīng)，無(wú)需純化，否則建議膠回收純化（貨號(hào)：DR01)。如果是以質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物則最好進(jìn)行純化，因?yàn)槟０遒|(zhì)粒也可能長(zhǎng)出菌落（但不是想構(gòu)建的目的載體）。

2.連接反應(yīng)：
1)室溫（20℃-30℃）按照如下體系操作（10μl 體系）：

純化后的PCR產(chǎn)物/或者1ul 1kb control	0.5-8ul
pTOPO-Blunt Simple Vector	1ul
10 ′ Enhancer	1ul
滅菌水	Xul
總體積	10ul

加完試劑后，用移液器輕輕吹打混勻或者輕彈管底混勻，低速瞬時(shí)離心收集所有液體在離心管底，注意此步驟不能在冰上進(jìn)行，只能在室溫（20℃-30℃）進(jìn)行。
注：如果使用5μl 體系連接，各成分按照比例減半使用，使用次數(shù)可以加倍。
不同大小插入片段的推薦用量：

插入片段大小（bp）	最佳用量（ng）
100-1000	20-50
1000-2000	50-100
2000-5000	100-200

2)室溫（20℃-30℃）連接5分鐘。
本載體推薦室溫5分鐘完成連接（不要超過(guò)5分鐘），但在很多情況下連接1-2分鐘已經(jīng)可以得到足夠多的轉(zhuǎn)化子。
3)連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或貯存于-20℃。
如尚未準(zhǔn)備好感受態(tài)細(xì)胞，可以將連接產(chǎn)物短時(shí)間置于冰上備用。

3.轉(zhuǎn)化：
1)50-100μl 感受態(tài)細(xì)胞，置于室溫解凍，完全解凍后（約1分鐘左右）輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。
2)加入5μl l連接液(最多可全部加入，只要體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的1/10)，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，本公司載體使用商品化的感受態(tài)細(xì)胞不需要冰浴和熱休克、室溫放置5分鐘便可獲得足夠多轉(zhuǎn)化子，如果實(shí)驗(yàn)室自制感受態(tài)細(xì)胞或者效率較低時(shí)，可以按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。
3)加300-500μl  LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm振蕩培養(yǎng)10分鐘。
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，一般可以直接將培養(yǎng)基（事先平衡至室溫） 加入感受態(tài)細(xì)胞的1.5 μl  離心管，蓋上離心管蓋，水平固定在振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)復(fù)蘇即可，不需要轉(zhuǎn)移到試管培養(yǎng)復(fù)蘇。
一般商品化的感受態(tài)細(xì)胞不超過(guò)2kb插入片段情況下，10分鐘復(fù)蘇可以得到足夠多轉(zhuǎn)化子，如果使用實(shí)驗(yàn)室自制的感受態(tài)或者插入片段長(zhǎng)轉(zhuǎn)化子少的情況下可以提高復(fù)蘇時(shí)間到30-60分鐘以得到更多的轉(zhuǎn)化子。
4)取200μl 菌液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜（如果預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)化子少，為得到較多克隆，4000 rpm 離心1 min，吸棄掉部分上清，保留100-150μl ，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）

4.轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
本制品陽(yáng)性率相當(dāng)高，一般情況下，可以達(dá)到所見(jiàn)即所得，只要是長(zhǎng)出來(lái)的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超過(guò)2-3kb的情況下可以不用鑒定直接挑1-2個(gè)菌去測(cè)序，。
1).用上述培養(yǎng)的白色菌落的菌液抽提質(zhì)粒，插入片段較大的情況下，直接跑電泳看質(zhì)粒大小就直接能鑒定出有插入的質(zhì)粒。
2).挑取菌落直接進(jìn)行PCR檢測(cè)（可參見(jiàn)分子克隆第3版本或者咨詢我們）。
3).用通用M13F/M13R引物測(cè)序來(lái)確定是否含有目的克隆。

pTOPO-Blunt Simple載體圖譜：