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高純度質粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)

HighPure Plasmid Mini Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產品介紹：
   本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。

二.產品特點：
1.離心吸附柱內硅基質膜采用進口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩(wěn)定的弊端。
2.獨有的去蛋白液配方，可以高效去除殘留的核酸酶，即使是核酸酶含量豐富的菌株如JM系列、HB101也可以輕松去除。有效防止了質粒被核酸酶降解。
3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質粒產量高、純度好， 可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

三.儲存條件：
1.第一次使用時，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液P1后（終濃度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質粒可能會有微量RNA殘留，在溶液P1中補加RNase A即可。
2.環(huán)境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

四.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2.提取質粒的量與細菌培養(yǎng)濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有關。一般高拷貝質粒，建議接種單菌落于1.5-4.5 ml加合適抗生素的LB培養(yǎng)基， 過夜培養(yǎng)14-16個小時，可提取出多達20μg的純凈質粒。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb的大質粒，應適當加大菌體使用量，使用5-10 ml過夜培養(yǎng)物，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步驟相同。
3.得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過90%。
4.質粒DNA確切分子大小， 必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的的質粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。
5.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

關于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應而影響其核酸的結合能力。硅膠柱經平衡液預處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團，提高核酸的結合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產量。平衡液是強堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時平衡液預處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

五.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
 提示：
  第一次使用前請先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
  將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后置于2-8℃保存。

1.取1.5-4.5 ml過夜培養(yǎng)的菌液，12,000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清，收集菌體。
收集超過1.5 ml菌液， 可以離心棄上清后，在同一個1.5ml管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2.用250μl溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

3.加250μl的溶液P2，溫和地上下翻轉6 -8次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。
溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應超過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。

4.加350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉6 -8次，充分混勻時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13,000rpm離心10分鐘，小心取上清。
加入溶液P3后應該立即混勻，以免產生SDS的局部沉淀。

平衡液預處理吸附柱：
使用平衡液預處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關于平衡液的使用”
5.將上一步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）， 12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

6.可選步驟:加入500μl去蛋白液PE，12,000rpm 離心30-60秒，棄廢液。
此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質，如所用菌株為JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應加此步驟；如所用菌株為XL-1 Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，則可略過此步驟。

7.加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

8.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

9.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

10.取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50-100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于30μl，體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量。

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