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無內毒素高純質粒大量提取試劑盒(離心柱型)

Endo-Free HighPure Plasmid Maxi Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產品介紹：

   本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，粗提物通過獨特的內毒素清除劑選擇性結合離心除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。

二.產品特點：
1.離心吸附柱內硅基質膜采用進口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好?？朔藝a試劑盒膜質量不穩(wěn)定的弊端。
2.不需要使用有毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀?？焖伲?方便，從150-300 ml大腸桿菌LB((Luria-Bertani)培養(yǎng)液中，可快速提取0.2-1.5mg純凈的高拷貝質粒DNA，提取率達80-90 %。
3.獨特配方清除內毒素，內毒素含量極低（<0.1 EU/μg DNA），細胞轉染效果極佳。也可直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序、等各種分子生物學實驗。

三.儲存條件：
1.第一次使用時，將試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液P1后（終濃度100ug/ml）置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質?？赡軙祀s有微量RNA殘留，在溶液P1中補加RNase A即可。
2.環(huán)境溫度低時溶液P2中SDS可能會析出出現(xiàn)渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
3.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

四.注意事項：
1.所有的離心步驟如未加另外說明均在室溫完成，使用轉速可以達到12,000 x g，帶50ml轉頭的臺式離心機。

2.提取的質粒量與細菌培養(yǎng)濃度、質?？截悢?shù)等因素有關。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb 的大質粒，應加大菌體使用量，同時按比例增加P1、P2、N3 的用量，洗脫緩沖液應在70℃預熱。適當延長吸附和洗脫的時間，以增加提取效率。

3.得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過90%。

4.質粒DNA確切分子大小， 必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的的質粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。

5.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫，質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

五.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
    第一次使用前請先在2瓶漂洗液WB瓶中分別加入100 ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
    將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后置于2-8℃保存。
1.取150-200 ml (最多不超過300 ml)過夜培養(yǎng)的菌液，12,000xg（約10,000rpm），離心1-2分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。
收集超過50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個50ml管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2.用7.5 ml溶液P1重懸菌體沉淀，移液器吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

3.加7.5 ml的溶液P2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解，室溫放置4-5分鐘。
溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時不應超過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠。如果很渾濁，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。

4.加7.5 ml溶液N3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000 x g離心10-15分鐘，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。
加入溶液N3后應該立即混勻，以免產生SDS的局部沉淀。

5.加入0.1體積(上清的體積的10%，約2.4ml)的內毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒旋轉混勻，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置5分鐘直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次。
內毒素清除劑加入上清后，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮（或稍渾濁）。

6.常溫放置3-5分鐘，溫度恢復室溫溶液很快變?yōu)闇啙幔嵉够靹颉?br /> 如室內溫度較低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，將很快變渾濁，顛倒混勻。

7.室溫8,000-10,000 x g離心10 分鐘分相 。上層水相含DNA，下層藍色油狀相含內毒素和其它雜質。將含DNA的上層水相轉移到新管（注意不要吸到藍色油狀層，里面含內毒素等雜質），棄油狀層。

8.向上層水相中加入0.5體積異丙醇（約11ml）后充分顛倒混勻后分多次（每次不超過15ml）轉入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），12,000 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。直到所有混合溶液通過此吸附柱。

9.加入10ml漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000 x g離心1分鐘，棄掉廢液。再加入10ml漂洗液WB，重復漂洗一次。

10.將吸附柱DC放回空收集管中，最高速（最好大于12,000 x g）離心3分鐘以干燥基質膜上殘留乙醇，用槍頭吸除內圈壓環(huán)和柱壁之間可能殘留的乙醇，打開蓋子室溫晾干3-5分鐘。
該步驟為徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制下游反應并且嚴重降低洗脫效率，降低質粒產量。

11.取出吸附柱DC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加1-2ml洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預熱可提高產量），室溫放置3分鐘，12,000 x g離心3分鐘。

 
推薦：為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置3分鐘，12,000 x g離心3分鐘。洗脫兩遍可提高濃度約10%。 

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是需注意體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量（最小不應少于1ml）。