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高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(離心柱型)

HighPure Plasmid Midi Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
   本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜采用進(jìn)口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。克服了國(guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.獨(dú)有的去蛋白液配方，可以高效去除殘留的核酸酶，即使是核酸酶含量豐富的菌株如JM系列、HB101也可以輕松去除。有效防止了質(zhì)粒被核酸酶降解。
3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好， 可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

三.適用范圍：
   適用于5-15ml 中等規(guī)模質(zhì)粒制備（mind preparations）

四.儲(chǔ)存條件：
1.第一次使用時(shí)，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液P1后（終濃度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的質(zhì)?？赡軙?huì)有微量RNA殘留，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可。
2.環(huán)境溫度低時(shí)溶液P2中SDS可能會(huì)析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過(guò)量的泡沫。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2.溶液P3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
3.提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒，建議取5-15 ml 過(guò)夜培養(yǎng)14-16個(gè)小時(shí)的菌液，可提取出多達(dá)50μg-60μg的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?0kb的大質(zhì)粒，應(yīng)適當(dāng)加大菌體使用量，使用10-20 ml過(guò)夜培養(yǎng)物，同時(shí)按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步驟相同。
4.得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過(guò)90%。
5.質(zhì)粒DNA確切分子大小， 必須酶切線性化后，對(duì)比DNA分子量Marker才可以知道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的的質(zhì)粒，泳動(dòng)位置不確定，無(wú)法通過(guò)電泳知道其確切大小。
6.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保pH大于7.5，pH過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在－20℃。質(zhì)粒DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

關(guān)于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長(zhǎng)期放置過(guò)程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強(qiáng)堿性溶液，若不小心碰到，請(qǐng)用大量自來(lái)水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過(guò)程中可能有沉淀生成，請(qǐng)加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個(gè)新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液預(yù)處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
提示：
   第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中加入指定量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
   將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后置于2-8℃保存。
   將溶液P3放在冰上預(yù)冷。

1.取5-15 ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，9,000rpm離心1-2分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。

2.用500μl溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮，全部轉(zhuǎn)入一個(gè)2ml離心管。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

3.加500μl的溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。
溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗帲悦饣蚪MDNA剪切斷裂！所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。

4.加700μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上靜置3-5分鐘，13,000rpm離心10分鐘，小心取上清。
加入溶液P3后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

平衡液預(yù)處理吸附柱：
使用平衡液預(yù)處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見(jiàn)前文“關(guān)于平衡液的使用”

5.將上一步所得上清分次加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）， 13,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

6.可選步驟:加入500μl去蛋白液PE，13,000rpm 離心30-60秒，棄廢液。
此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質(zhì)，如所用菌株為JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應(yīng)加此步驟；如所用菌株為XL-1 Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，則可略過(guò)此步驟。

7.加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

8.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

9.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

10.取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl-250洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2-5分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于80μl，體積過(guò)小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。