產(chǎn)品中心

nfo DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒(試紙條型)

包裝規(guī)格：

用于DNA擴(kuò)增，試紙條檢測(cè)

配套使用產(chǎn)品：

一. 原理概述：
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計(jì)的特異的分子探針，使用膠體金技術(shù)（三明治夾心法）可以對(duì)最終結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

二. 產(chǎn)品特點(diǎn)：
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短（僅需12 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡(jiǎn)便，易于保存。
本試劑對(duì)設(shè)備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進(jìn)行反應(yīng)操作，無需購(gòu)買PCR擴(kuò)增儀等價(jià)格高昂的專屬設(shè)備。

三. 引物設(shè)計(jì)：
1. 建議使用長(zhǎng)度在 30-35 bp的引物，引物過短會(huì)影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度；

2. 堿基排布隨機(jī)性高，GC 含量在 30%-70%之間；

3. 下游引物的5’端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)（常用生物素Biotin）；

4. 引物設(shè)計(jì)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；

5. 擴(kuò)增子長(zhǎng)度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

四. 熒光探針設(shè)計(jì)：
在上下游引物中間，設(shè)計(jì)一段長(zhǎng)度為 46-52nt 與目的片段互補(bǔ)的序列作為膠體金探針；
探針序列不與特異性引物識(shí)別位點(diǎn)重疊，長(zhǎng)度為 46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。

探針共有三個(gè)修飾位點(diǎn)：
1. 5’端修飾一個(gè)抗原標(biāo)記（FAM）；
2. 在距 5’端約 30nt 序列位置上標(biāo)記一個(gè) dSpacer（四氫呋喃，THF），作為 nfo 的識(shí)別位點(diǎn)；
3. THF 距離 3’末端約 15 nt，并且 3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或 C3-spacer。

提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
1).每個(gè)干粉反應(yīng)管加入32.9 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生影響）；

2).每個(gè)反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對(duì)于多個(gè)反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3).向反應(yīng)管中依次加入5 μL ddH2O和5 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為10 μL）；

4).最后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B Buffer并充分混合（對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，建議將B Buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；

5).混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37-39 oC孵育8-12 mins；

6).反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，吸取 50uL稀釋的產(chǎn)物滴加在膠體金卡點(diǎn)樣孔中3-5 mins，觀察質(zhì)控線與檢測(cè)線判讀結(jié)果。

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