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Annexin V-FITC/PI Kit凋亡檢測試劑盒

包裝規(guī)格：

17104-50	Annexin V-FITC/PI Kit凋亡檢測試劑盒	50T	1060元
17104-100	Annexin V-FITC/PI Kit凋亡檢測試劑盒	100T	1820元

產品介紹:

細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外，使 PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使 PS暴露在細胞膜外。AnnexinV具有易于結合到磷脂類如PS的特性，對 PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用 AnnexinV與 PI雙染的方法，通過流式檢測細胞早期凋亡。

儲存條件:

2-8℃避光保存,勿冰凍。

注意事項:

本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。此產品僅供研究，不用于臨床診斷。

試劑盒組份： 
1.結合緩沖液 4x(Binding Buffer4x)
體積： 20Tests: 4ml（4倍濃縮液） 50Tests: 10ml（4倍濃縮液） 100Tests: 20ml（4倍濃縮液）

稀釋后溶液中各組分濃度： 10mM Hepes/NaOH, pH 7.4,140mM NaCl, 2.5mM CaCl2 

2.碘化丙錠溶液（ Propidium Iodide, PI）

體積： 

50Tests: 0.5ml 

100Tests: 1.0ml

濃度： 20ug/ml 

3.重組人 Annexin V/FITC, (rhAnnexin V/FITC)

來源：大腸桿菌（ E.coli）

分子量： 35.8KDa

樣品量：

50Tests: 0.25ml，可用于50次實驗

100Tests: 0.5ml，可用于100次實驗。

保存方法：于50mMTris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存。
純度： SDS-PAGE及反相HPLC表明純度大于98%。
生物活性： AnnexinV可結合于磷酯酰絲氨酸并表現出抗磷酯酶活性。 

操作步驟： 
1.細胞樣品的準備： 
a)對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內備用。用不含 EDTA的胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。 1000rpm左右離心 5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完全離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約 1ml 4℃預冷的 PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。 
b)對于懸浮細胞： 1000rpm左右離心 5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞無法完全離心至離心管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約 1ml4℃預冷的 PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。 
2.用去離子水按1:3稀釋結合緩沖液 (4ml 4x結合緩沖液+12ml去離子水)； 
3.用1x結合緩沖液重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為 1-5×10⁶/ml； 
4.取100μl的細胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育 5分鐘； 
5.加入10μl 20ug/ml的碘化丙錠溶液 (PI)，并加 400μl PBS，立刻進行流式檢測。

實驗設計：

空白管：陰性對照組細胞，不加 Annexin V/FITC，碘化丙錠溶液 (PI)。用于調節(jié)電壓。

單染管：陽性對照組細胞，只加 Annexin V/FITC。用于調節(jié)補償。

檢測管：處理的細胞，加 Annexin V/FITC，碘化丙錠溶液 (PI)。

用空白管和單染管調節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數據。

常見問題： 
1、Annexin V/ PI凋亡檢測的試劑盒能否檢測人以外其他動物的細胞凋亡情況？

可以。因為 Annexin V是與磷脂酰絲氨酸 (PS)親和，而 PS在不同種屬間沒差異。在正常細胞中， PS只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期， PS由脂膜內側翻向外側。 
2、貼壁細胞做凋亡用胰酶消化下來對細胞膜損傷？

低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細胞 2～3次，離心機 4℃1000rpm 5min離心，處理得當的話，胰酶造成損傷可以控制在 5%以內，有對照組的情況下對實驗結果不會造成明顯影響。 
3、貼壁細胞可以先染 PI然后再消化下來嗎？這樣是否可以減小由于消化液造成的細胞膜破損而染上的 PI 的誤差？

先加 PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI本身對細胞也是有毒性的，對實驗結果影響會比胰酶大，不建議這樣做。
4、為什么只能用不含 EDTA的胰酶消化貼壁細胞，用含 EDTA的胰酶消化細胞對結果有什么影響？

因為 Annexin V是 Ca依賴的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA螯合了 Ca離子從而影響 Annexin V，進而影響結果。 
5、有些廠家說明書 Annexin V和 PI一起加？為什么你們先加 Annexin V后加 PI ？

用流式檢測凋亡時， PI受時間的影響很大，因標記了 PI后會加大細胞毒性，隨著時間延長會導致 PI的染色增加，特別是檢測早期凋亡時，如果時間延長除了會導致在流式細胞儀上的細胞分群差距加大外，誤差會明顯加大。一般 PI加上后立刻上機，然后在一個小時內檢測完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成的誤差會更小。 
6、你們哪種凋亡檢測試劑盒能用于轉染 GFP細胞的凋亡檢測？ 
1708 Annexin V-PE/7AAD凋亡檢測試劑盒 
1706 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡檢測試劑盒

實驗參考圖：