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Annexin V-eGFP/PI Kit流式檢測(cè)試劑盒

包裝規(guī)格：

17107-50	Annexin V-eGFP/PI Kit凋亡檢測(cè)試劑盒	50T	1060元
17107-100	Annexin V-eGFP/PI Kit凋亡檢測(cè)試劑盒	100T	1820元

產(chǎn)品介紹:

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用AnnexinV與PI雙染的方法，通過流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。

儲(chǔ)存條件:
2-8℃避光保存,勿冰凍。

注意事項(xiàng):
本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
此產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床診斷。

試劑盒組份： 
1.結(jié)合緩沖液 4x(Binding Buffer 4x)
體積：
50Tests: 10ml（4倍濃縮液） 
100Tests: 20ml（4倍濃縮液）
稀釋后溶液中各組分濃度：10mM Hepes/NaOH, pH 7.4,140mM NaCl, 2.5mM CaCl2 

2.碘化丙錠溶液（Propidium Iodide, PI）
體積：
50Tests: 0.5ml 
100Tests: 1.0ml
濃度： 20ug/ml 

3.重組人 Annexin V/eGFP, (rh Annexin V/eGFP)
來源：大腸桿菌（ E.coli）
分子量： 35.8KDa
樣品量：
50Tests: 0.25ml，可用于 50次實(shí)驗(yàn)
100Tests: 0.5ml，可用于 100次實(shí)驗(yàn)

保存方法：于 50mMTris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存。
純度： SDS-PAGE及反相HPLC表明純度大于98%
生物活性： AnnexinV可結(jié)合于磷酯酰絲氨酸并表現(xiàn)出抗磷酯酶活性。

操作步驟： 
1.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備： 
a)對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無法完全離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。 
b)對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無法完全離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。 
2.用去離子水按1:3稀釋結(jié)合緩沖液(4ml 4x結(jié)合緩沖液+12ml去離子水)； 
3.用1x結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×106/ml； 
4.取100μl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5μlAnnexin V/eGFP混勻后于室溫避光孵育 5分鐘； 
5.加入10μl 20ug/ml的碘化丙錠溶液(PI)，并加400μl PBS，立刻進(jìn)行流式檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，不加Annexin V/eGFP，碘化丙錠溶液(PI)。用于調(diào)節(jié)電壓。
單染管：陽性對(duì)照組細(xì)胞，只加 Annexin V/eGFP。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/eGFP，碘化丙錠溶液(PI)。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。

常見問題： 
1、Annexin V/ PI凋亡檢測(cè)的試劑盒能否檢測(cè)人以外其他動(dòng)物的細(xì)胞凋亡情況？
可以。因?yàn)?Annexin V是與磷脂酰絲氨酸 (PS)親和，而 PS在不同種屬間沒差異。在正常細(xì)胞中， PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期， PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。 

2、貼壁細(xì)胞做凋亡用胰酶消化下來對(duì)細(xì)胞膜損傷？

低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞2～3次，離心機(jī)4℃1000rpm 5min離心，處理得當(dāng)?shù)脑?，胰酶造成損傷可以控制在5%以內(nèi)，有對(duì)照組的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響。 

3、貼壁細(xì)胞可以先染 PI然后再消化下來嗎？這樣是否可以減小由于消化液造成的細(xì)胞膜破損而染上的 PI的誤差？

先加 PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI 本身對(duì)細(xì)胞也是有毒性的，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會(huì)比胰酶大，不建議這樣做。 

4、為什么只能用不含 EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，用含 EDTA的胰酶消化細(xì)胞對(duì)結(jié)果有什么影響？

因?yàn)?Annexin V是 Ca 依賴的蛋白，所以不能加入 EDTA，防止 EDTA螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V，進(jìn)而影響結(jié)果。 

5、有些廠家說明書Annexin V和 PI一起加？為什么你們先加 Annexin V后加 PI ？

用流式檢測(cè)凋亡時(shí)， PI受時(shí)間的影響很大，因標(biāo)記了 PI后會(huì)加大細(xì)胞毒性，隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致 PI的染色增加，特別是檢測(cè)早期凋亡時(shí)，如果時(shí)間延長(zhǎng)除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外，誤差會(huì)明顯加大。一般 PI加上后立刻上機(jī)，然后在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完成。兩種方法都可以，但是按照我們操作步驟造成的誤差會(huì)更小。 

6、你們哪種凋亡檢測(cè)試劑盒能用于轉(zhuǎn)染 GFP細(xì)胞的凋亡檢測(cè)？ 
1708 Annexin V-PE/7AAD凋亡檢測(cè)試劑盒 
1706 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡檢測(cè)試劑盒

實(shí)驗(yàn)參考圖:

Jurkat細(xì)胞用紫外誘導(dǎo)凋亡后用Annexin V-eGFP/PI雙染流式分析圖譜