Annexin V-PE/7-AAD Kit凋亡檢測(cè)試劑盒
包裝規(guī)格：
|
17108-50
|
Annexin V-PE/7-AAD Kit凋亡檢測(cè)試劑盒
|
50T
|
1060元
|
|
17108-100
|
Annexin V-PE/7-AAD Kit凋亡檢測(cè)試劑盒
|
100T
|
1820元
|
產(chǎn)品介紹:
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對(duì)PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以采用 AnnexinV與7AAD雙染的方法，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。
儲(chǔ)存條件:
2-8℃避光保存,勿冰凍。
注意事項(xiàng):
本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
此產(chǎn)品僅供研究，不用于臨床診斷。
試劑盒組份：
1.結(jié)合緩沖液 4x(Binding Buffer 4x)
體積：
50Tests: 10ml（4倍濃縮液）
100Tests: 20ml（4倍濃縮液）
稀釋后溶液中各組分濃度：10mM Hepes/NaOH, pH7.4,140mM NaCl, 2.5mM CaCl2
2.7-AAD Viability Staining Solution
體積：
50Tests: 0.5ml
100Tests: 1.0ml
濃度： 20ug/ml
3.重組人Annexin V/PE, (rh Annexin V/PE)
來(lái)源：大腸桿菌（ E.coli）
分子量： 35.8KDa
樣品量：
50Tests: 0.25ml，可用于50次實(shí)驗(yàn)
100Tests: 0.5ml，可用于100次實(shí)驗(yàn)
保存方法：于50mMTris, 100mM NaCl, 1%BSA, 0.02%NaN3,pH7.4溶液中保存。
純度：SDS-PAGE及反相 HPLC表明純度大于98%
生物活性：AnnexinV可結(jié)合于磷酯酰絲氨酸并表現(xiàn)出抗磷酯酶活性。
操作步驟：
1.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
a)對(duì)于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來(lái)時(shí)，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。 1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法完全離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。
b)對(duì)于懸浮細(xì)胞：1000rpm左右離心5min，沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無(wú)法完全離心至離心管底，可以適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml4℃預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。
2.用去離子水按1:3稀釋結(jié)合緩沖液 (4ml 4x結(jié)合緩沖液+12ml去離子水 )；
3.用1x結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×106/ml；
4.取100μl的細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE混勻后于室溫避光孵育5分鐘；
5.加入10μl 20ug/ml的7AAD，并加400μl PBS，立刻進(jìn)行流式檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
1)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞
空白管：陰性對(duì)照組細(xì)胞，不加Annexin V/PE，7AAD。用于調(diào)節(jié)。
電壓?jiǎn)稳竟?兩管)：有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/PE，7AAD。用空白管和單陽(yáng)管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
2)轉(zhuǎn)染 GFP細(xì)胞
未轉(zhuǎn)染空白管：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，不加Annexin V/PE，7AAD。用于調(diào)電壓。
未轉(zhuǎn)染單染管：未轉(zhuǎn)染且有明顯凋亡的細(xì)胞，只加Annexin V/PE或只加7AAD。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
轉(zhuǎn)染GFP空白管：轉(zhuǎn)染GFP對(duì)照組細(xì)胞，不加Annexin V/PE，7AAD。用于調(diào)補(bǔ)償。
檢測(cè)管：處理的細(xì)胞，加Annexin V/PE，7AAD。調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
常見(jiàn)問(wèn)題：
1、Annexin V/7AAD凋亡檢測(cè)的試劑盒能否檢測(cè)人以外其他動(dòng)物的細(xì)胞凋亡情況？
可以。因?yàn)?Annexin V是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和，而 PS在不同種屬間沒(méi)差異。在正常細(xì)胞中， PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期， PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。
2、貼壁細(xì)胞做凋亡用胰酶消化下來(lái)對(duì)細(xì)胞膜損傷？
低濃度胰酶消化，輕柔吹打貼壁細(xì)胞 2～3次，離心機(jī) 4℃1000rpm 5min離心，處理得當(dāng)?shù)脑挘让冈斐蓳p傷可以控制在 5%以內(nèi)，有對(duì)照組的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響。
3、貼壁細(xì)胞可以先染 PI然后再消化下來(lái)嗎？這樣是否可以減小由于消化液造成的細(xì)胞膜破損而染上的 PI的誤差？
先加 PI不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷，而且 PI本身對(duì)細(xì)胞也是有毒性的，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會(huì)比胰酶大，不建議這樣做。
4、為什么只能用不含 EDTA的胰酶消化貼壁細(xì)胞，用含 EDTA的胰酶消化細(xì)胞對(duì)結(jié)果有什么影響？
因?yàn)锳nnexin V是Ca依賴的蛋白，所以不能加入EDTA，防止EDTA螯合了Ca離子從而影響Annexin V，進(jìn)而影響結(jié)果。
5、你們哪種凋亡檢測(cè)試劑盒能用于轉(zhuǎn)染GFP細(xì)胞的凋亡檢測(cè)？
1708 Annexin V-PE/7AAD Kit凋亡檢測(cè)試劑盒
1706 AnnexinV-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡檢測(cè)試劑盒
實(shí)驗(yàn)參考圖：
