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酵母高純度質(zhì)粒大量快速提取試劑盒（離心柱型）

Yeast HighPure Plasmid Maxi Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
   本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞并結(jié)合破壁酶特異消化酵母細(xì)胞壁，能在1小時(shí)內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中分離出高純度質(zhì)粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除細(xì)胞壁后,然后堿裂法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除， 最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜采用進(jìn)口公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝?guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測(cè)序等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

三.適用范圍：
   適用于大規(guī)模高純度酵母質(zhì)粒制備

四.儲(chǔ)存條件：
1.第一次使用時(shí)，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液YP1（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的質(zhì)?？赡軙?huì)有微量RNA殘留，在溶液YP1中補(bǔ)加RNase A即可。
2.環(huán)境溫度低時(shí)溶液YP2中SDS可能會(huì)析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過(guò)量的泡沫。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟如未加另外說(shuō)明均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到至少6,000xg，帶50ml轉(zhuǎn)頭的臺(tái)式離心機(jī)。

2.溶液YP3和去蛋白液PD中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

3.通常酵母質(zhì)?？截悢?shù)都很低，高拷貝質(zhì)粒最大得率一般為每5 ml 培養(yǎng)物提取1μg左右的質(zhì)粒。用于下游試驗(yàn)時(shí)通常建議使用量為： 1-5μl用做PCR 模板;5-10μl 用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌,選擇高效率的感受態(tài)細(xì)胞。

4.得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成， 與提取物培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺旋可以超過(guò)90%。

5.用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巰基乙醇)。配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié)PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.1%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M)。

6.菌體濃度檢測(cè)一般OD600值為1的時(shí)候,釀酒酵母細(xì)胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和分光度計(jì)不同即使同樣細(xì)胞數(shù)量OD值變化也很大，以上僅供參考。

7.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5， pH過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在－20℃。質(zhì)粒DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
   提示：
   第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入指定量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
   將RNase A全部加入溶液P1中，混勻。每次使用后置于2-8℃保存。
   將溶液P3放在冰上預(yù)冷。
   吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巰基乙醇，回復(fù)到室溫備用。

1.取約100-180毫升酵母培養(yǎng)物，6000xg，離心10分鐘，盡可能的倒干上清，收集菌體。
收集超過(guò)50毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個(gè)50ml管內(nèi)加入更多的菌液，重復(fù)步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2.加入10ml Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細(xì)胞；加入0.1g 破壁酶（破壁酶臨用前用2ml Sorbitol buffer溶解），充分顛倒混勻，37℃溫育1-2小時(shí)消化細(xì)胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化。
如果破壁效果不好導(dǎo)致質(zhì)粒產(chǎn)量過(guò)低，可以加大破壁酶用量來(lái)提高酶工作濃度，還可以延長(zhǎng)消化時(shí)間或者提高溫度到45℃來(lái)提高效果，不適合破壁消化的酵母可選用Lyticase 或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠渦旋振蕩，反復(fù)凍融等。

3.6000xg，離心10分鐘，盡可能吸棄上清，加入7ml溶液YP1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

4.加7ml的溶液YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。
溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準(zhǔn)確的5分鐘。如果未變得清亮，可能由于菌體過(guò)多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。

5.加10ml溶液YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次，充分混勻此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。冰上靜置5-10分鐘，4℃ ，至少2500xg離心20分鐘(加大離心力可相應(yīng)縮短離心時(shí)間,如15000xg離心10分鐘)，小心取上清，避免吸取到漂浮的白色沉淀。
加入溶液YP3后應(yīng)該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀，如果上清中還有飄浮白色沉淀，可再次離心后取上清。

6.可選,一般不需要:4℃，2500xg 再次離心10 分鐘，小心取上清。

7.將上一步所得上清加入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管中），靜置2分鐘，2500xg離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。
如果上清體積超過(guò)20ml，可以分多次過(guò)柱。

8.加入10ml去蛋白液PD，2500xg離心2分鐘，棄掉廢液。

9.加入10ml漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），2500xg離心2分鐘，棄掉廢液。

10.重復(fù)操作步驟9一次。

11.將吸附柱DC放回空收集管中，最高速（最好大于9000xg，如果離心機(jī)轉(zhuǎn)速低，需要相應(yīng)延長(zhǎng)離心時(shí)間）離心10分鐘以干燥膜基質(zhì)殘留乙醇，用槍頭吸除內(nèi)圈壓環(huán)和柱壁之間可能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾干幾分鐘。
該步驟目的為徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制下游反應(yīng)并且嚴(yán)重降低洗脫效率，降低質(zhì)粒產(chǎn)量。如果洗脫產(chǎn)量低，則必須加做步驟12。

12.可選步驟: 選擇以下兩種方法之一干燥柱子：
 1)取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分鐘；
 2)將柱子放置于60－65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10-15分鐘。

13.取出吸附柱DC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加1ml洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置2分鐘，6000 xg離心5分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心2分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于0.6ml，體積過(guò)小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。